Vaccination using live attenuated Leishmania donovani centrin deleted parasites induces protection in dogs against Leishmania infantum.

Live attenuated Leishmania donovani parasites such as LdCen(-/-) have been shown elicit protective immunity against leishmanial infection in mice and hamster models. Previously, we have reported on the induction of strong immunogenicity in dogs upon vaccination with LdCen(-/-) including an increase in immunoglobulin isotypes, higher lymphoproliferative response, higher frequencies of activated CD4(+) and CD8(+) T cells, IFN-γ production by CD8(+) T cells, increased secretion of TNF-α and IL-12/IL-23p40 and, finally, decreased secretion of IL-4. To further explore the potential of LdCen(-/-) parasites as vaccine candidates, we performed a 24-month follow up of LdCen(-/-) immunized dogs after challenge with virulent Leishmania infantum, aiming determination of parasite burden by qPCR, antibody production (ELISA) and cellular responses (T cell activation and cytokine production) by flow cytometry and sandwich ELISA. Our data demonstrated that vaccination with a single dose of LdCen(-/-) (without any adjuvant) resulted in the reduction of up to 87.3% of parasite burden after 18 months of virulent challenge. These results are comparable to those obtained with commercially available vaccine in Brazil (Leishmune(®)). The protection was associated with antibody production and CD4(+) and CD8(+) proliferative responses, as well as T cell activation and significantly higher production of IFN-γ, IL-12/IL-23p40 and TNF-α, which was comparable to responses induced by immunization with Leishmune(®), with significant differences when compared to control animals (Placebo). Moreover, only animals immunized with LdCen(-/-) expressed lower levels of IL-4 when compared to animals vaccinated either with Leishmune(®) or PBS. Our results support further studies aiming to demonstrate the potential of genetically modified live attenuated L. donovani vaccine to control L. infantum transmission in endemic areas for CVL.

Canine skin and conjunctival swab samples for the detection and quantification of Leishmania infantum DNA in an endemic urban area in Brazil.

BACKGROUND: We evaluated kDNA PCR/hybridization and quantitative real-time PCR (qPCR) targeting the gene of DNA polymerase of Leishmania infantum for CVL diagnosis and assessment of parasite load in clinical samples obtained invasively and non-invasively. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Eighty naturally infected dogs from an endemic urban area in Brazil were used. Animals were divided into two groups based on the presence or absence of CVL clinical sings. Skin biopsies, bone marrow, blood and conjunctival swabs samples were collected and submitted to L. infantum DNA detection. In addition, anti-Leishmania antibody titers were measured by Immunofluorescence antibody test. The symptomatic dogs had increased titers compared to asymptomatic dogs (P = 0.025). The frequencies of positive results obtained by kDNA PCR/hybridization for asymptomatic and symptomatic dogs, respectively, were as follows: right conjunctiva, 77.5% and 95.0%; left conjunctiva, 75.0% and 87.5%; skin, 45.0% and 75.0%; bone marrow, 50.0% and 77.5%; and blood, 27.5% and 22.5%. In both groups, the parasite load in the skin samples was the highest (P<0.0001). The parasite loads in the conjunctival swab and bone marrow samples were statistically equivalent within each group. The parasite burden in conjunctival swabs was higher in the dogs with clinical signs than in asymptomatic dogs (P = 0.028). This same relationship was also observed in the bone marrow samples (P = 0.002). No differences in amastigotes load in the skin were detected between the groups. CONCLUSIONS: The conjunctival swab is a suitable clinical sample for qualitative molecular diagnosis of CVL. The highest parasite burdens were detected in skin regardless of the presence of VL-associated clinical signs. The qPCR results emphasized the role of dogs, particularly asymptomatic dogs, as reservoirs for CVL because of the high cutaneous parasite loads. These results may help to explain the maintenance of high transmission rates and numbers of CVL cases in endemic urban regions.

Envolvimento de citocinas, quimiocinas e fatores de trancrição na imunopatologia da pele de cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi, portadores de diferentes formas clínicas e densidades parasitárias cutâneas

A resposta imune na pele de cães infectados por Leishmania chagasi e sua associação com parasitismo tecidual e progressão clínica da leishmaniose visceral canina (LVC) é pouco compreendido e há poucos estudos disponíveis Nesse trabalho, uma análise detalhada do perfil de citocinas (IFN-γ, IL-12p40, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 e TGF-β1), fatores de transcrição (T-bet, GATA-3 e FOXP3) e quimiocinas (CCL2, CCL4, CCL5, CCL13, CCL17, CCL21, CCL24 e CXCL8), assim como, as células inflamatórias (neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, basófilos e linfócitos), foram realizados na pele de 35 cães naturalmente infectados usando PCR em tempo real juntamente com as determinações da densidade parasitária da pele e do estado clínico do LVC. Diante da complexa rede de interação citocinas/quimiocinas, de um modo geral, foi observado que vários biomarcadores evidenciados com o desenvolvimento do presente trabalho envolvidos na resistência apresentavam-se relacionados à forma assintomática e com baixo parasitismo, enquanto outros associados com suscetibilidade foram detectados simultaneamente em cães sintomáticos e com alto parasitismo cutâneo. Um perfil misto de citocina com altos níveis de expressão de IFN-g, TNF-α, IL-5 e IL-13 foi determinado em cães assintomáticos Adicionalmente, a manutenção da forma assintomática está intimamente envolvida com aumento da razão IFN-γ/IL-4 e com o controle do parasitismo dérmico que é caracterizado pelo aumento da razão IFN-γ/IL-10 e IL-12/IL-10, indicando que IFN-γ e IL-12 exercem um papel fundamental no equilíbrio da relação parasito/hospedeiro. Além disso, altos níveis de IL-10 e TGF-β1, concomitante com a baixa expressão de IL-12, pode representar uma condição fundamental que permite a persistência da replicação do parasito na derme Adicionalmente, os níveis dos fatores de transcrição GATA-3 e FOXP3 foram correlacionados com a doença assintomática.

De forma interessante, cães oligossintomáticos parecem manifestar uma doença intermediária com determinadas tendências de padrão de reposta imune. Durante a passagem por essa forma clínica, ocorre um predomínio de citocinas moduladoras (IL-10 e TGF-β1) na derme que explica o aumento progressivo da densidade parasitária observada nesses animais. Além disso, durante a passagem por esta forma oligosssintomática os níveis de IL-13 decaem e em cães com médio parasitismo e passa a ocorrer uma migração preferencial de eosinófilos que estão intimamente relacionados ao aumento de CCL24. Com o avançar do parasitismo, forma-se um moderado infiltrado inflamatório decorrente da migração diferencial de macrófagos e linfócitos que é orquestrado por citocinas do Tipo I (IL-12, TNF-α e IFN-γ) e fator de transcrição T-bet, presença marcante nesse microambiente. A forma grave da LVC é caracterizada pelo aparecimento de inúmeros sinais clínicos e por uma debilidade em controlar o parasitismo levando muitas vezes os cães ao óbito. Nesse contexto, a forma sintomática é marcada por uma queda de TNF-α e IL-13 associado a uma queda de expressão de GATA-3 e FOXP3 podendo explicar a inabilidade de macrófagos em controlar a infecção devido à perda da ação de TNF-α e IFN-γ, praticamente ausentes na pele. O intenso infiltrado inflamatório na derme é explicado por um perfil de citocinas Tipo I (TNF-α e IFN-γ) expressas concomitante com citocinas reguladoras. (IL-10 e TGF-β) presentes nesse microambiente, reforçado por baixa expressão de IL-12 e IL-13. A visceralização do parasito leva a uma hipertrofia e hiperplasia de órgãos linfóides que pode estar sendo ocasionada pelo aumento dos níveis de CCL21 em animais com alto parasitismo cutâneo.

Essa quimiocina é responsável pelo recrutamento de APCs presentes na pele e sua condução para os linfonodos no intuito de promover aumento da apresentação de antígenos parasitários aos linfócitos T, o que parece não ocorrer devido ao perfil de citocinas (Tipo II) e/ou reguladoras expressas por esses cães. Além do mais, as quimiocinas CCL2, CCL4 e CCL5 são responsáveis pelo orquestramento do fluxo celular de monócitos e plamócitos para compor o intenso infiltrado inflamatório dérmico. Um avanço no conhecimento dos mecanismos que determinam a resposta imune protetora da infecção por L. chagasi nos cães permitirá o estabelecimento de uma estratégia racional para o desenvolvimento de vacinas e terapias imunológicas contra LVC.

Envolvimento de citocinas, quimiocinas e fatores de trancrição na imunopatologia da pele de cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi, portadores de diferentes formas clínicas e densidades parasitárias cutâneas / Involvement of cytokines, chemokines and transcription factors in the immunopathology of the skin of dogs naturally infected by Leishmania (Leishmania) chagasi, having different clinical forms and densities parasitic skin

A resposta imune na pele de cães infectados por Leishmania chagasi e sua associação com parasitismo tecidual e progressão clínica da leishmaniose visceral canina (LVC) é pouco compreendido e há poucos estudos disponíveis Nesse trabalho, uma análise detalhada do perfil de citocinas (IFN-γ, IL-12p40, TNF-α, IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 e TGF-β1), fatores de transcrição (T-bet, GATA-3 e FOXP3) e quimiocinas (CCL2, CCL4, CCL5, CCL13, CCL17, CCL21, CCL24 e CXCL8), assim como, as células inflamatórias (neutrófilos, eosinófilos, macrófagos, basófilos e linfócitos), foram realizados na pele de 35 cães naturalmente infectados usando PCR em tempo real juntamente com as determinações da densidade parasitária da pele e do estado clínico do LVC. Diante da complexa rede de interação citocinas/quimiocinas, de um modo geral, foi observado que vários biomarcadores evidenciados com o desenvolvimento do presente trabalho envolvidos na resistência apresentavam-se relacionados à forma assintomática e com baixo parasitismo, enquanto outros associados com suscetibilidade foram detectados simultaneamente em cães sintomáticos e com alto parasitismo cutâneo. Um perfil misto de citocina com altos níveis de expressão de IFN-g, TNF-α, IL-5 e IL-13 foi determinado em cães assintomáticos Adicionalmente, a manutenção da forma assintomática está intimamente envolvida com aumento da razão IFN-γ/IL-4 e com o controle do parasitismo dérmico que é caracterizado pelo aumento da razão IFN-γ/IL-10 e IL-12/IL-10, indicando que IFN-γ e IL-12 exercem um papel fundamental no equilíbrio da relação parasito/hospedeiro. Além disso, altos níveis de IL-10 e TGF-β1, concomitante com a baixa expressão de IL-12, pode representar uma condição fundamental que permite a persistência da replicação do parasito na derme Adicionalmente, os níveis dos fatores de transcrição GATA-3 e FOXP3 foram correlacionados com a doença assintomática.

De forma interessante, cães oligossintomáticos parecem manifestar uma doença intermediária com determinadas tendências de padrão de reposta imune. Durante a passagem por essa forma clínica, ocorre um predomínio de citocinas moduladoras (IL-10 e TGF-β1) na derme que explica o aumento progressivo da densidade parasitária observada nesses animais. Além disso, durante a passagem por esta forma oligosssintomática os níveis de IL-13 decaem e em cães com médio parasitismo e passa a ocorrer uma migração preferencial de eosinófilos que estão intimamente relacionados ao aumento de CCL24. Com o avançar do parasitismo, forma-se um moderado infiltrado inflamatório decorrente da migração diferencial de macrófagos e linfócitos que é orquestrado por citocinas do Tipo I (IL-12, TNF-α e IFN-γ) e fator de transcrição T-bet, presença marcante nesse microambiente. A forma grave da LVC é caracterizada pelo aparecimento de inúmeros sinais clínicos e por uma debilidade em controlar o parasitismo levando muitas vezes os cães ao óbito. Nesse contexto, a forma sintomática é marcada por uma queda de TNF-α e IL-13 associado a uma queda de expressão de GATA-3 e FOXP3 podendo explicar a inabilidade de macrófagos em controlar a infecção devido à perda da ação de TNF-α e IFN-γ, praticamente ausentes na pele. O intenso infiltrado inflamatório na derme é explicado por um perfil de citocinas Tipo I (TNF-α e IFN-γ) expressas concomitante com citocinas reguladoras. (IL-10 e TGF-β) presentes nesse microambiente, reforçado por baixa expressão de IL-12 e IL-13. A visceralização do parasito leva a uma hipertrofia e hiperplasia de órgãos linfóides que pode estar sendo ocasionada pelo aumento dos níveis de CCL21 em animais com alto parasitismo cutâneo.

Essa quimiocina é responsável pelo recrutamento de APCs presentes na pele e sua condução para os linfonodos no intuito de promover aumento da apresentação de antígenos parasitários aos linfócitos T, o que parece não ocorrer devido ao perfil de citocinas (Tipo II) e/ou reguladoras expressas por esses cães. Além do mais, as quimiocinas CCL2, CCL4 e CCL5 são responsáveis pelo orquestramento do fluxo celular de monócitos e plamócitos para compor o intenso infiltrado inflamatório dérmico. Um avanço no conhecimento dos mecanismos que determinam a resposta imune protetora da infecção por L. chagasi nos cães permitirá o estabelecimento de uma estratégia racional para o desenvolvimento de vacinas e terapias imunológicas contra LVC.